巴音郭楞一種炔螨特半抗原及其合成方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于食品安全檢測的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種炔螨特半抗原及其合成方法和應(yīng)用。


背景技術(shù)：

炔螨特又名克螨特，它是一種高效、低毒、廣譜、持效期長的有機硫殺螨劑,可以有效防治螨類危害，對成螨和若螨有特效，可用于防治棉花、蔬菜、蘋果、柑桔、茶、花卉等作物各種害螨。具有防治效果好、成本低、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點。其對人畜毒性低，對天敵和經(jīng)濟昆蟲如瓢蟲、草蛉、蜜蜂和家蠶均安全。由于其藥效顯著，不易產(chǎn)生抗藥性而深受歡迎。少量的農(nóng)藥殘留不會導(dǎo)致急性中毒，但長期食用炔螨特殘留超標(biāo)的蔬果，可能對人體健康產(chǎn)生一定的不良影響，存在安全隱患。

現(xiàn)有的炔螨特的檢測方法主要有高效液相色譜法(hplc)、氣相色譜法(gc)、液相-質(zhì)譜聯(lián)用(lc-ms)法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gc-ms)等，上述檢測方法中所用儀器設(shè)備操作復(fù)雜、成本高、對操作人員技術(shù)要求高，且不能立即顯示結(jié)果，不適用于食品、商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對懷疑對象進行快速的在線檢測和監(jiān)控。

與上述檢測方法相比，免疫學(xué)檢測技術(shù)具有經(jīng)濟、快速、技術(shù)要點低、操作簡便且可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等特點。免疫分析檢測技術(shù)是近年來在環(huán)境及食品檢測等領(lǐng)域開發(fā)出來的一種新型快速準(zhǔn)確檢測方法，現(xiàn)已逐漸成為世界各國有毒有害殘留物快速篩選檢測的主要方法之一。

在建立免疫學(xué)檢測方法并應(yīng)用該檢測方法檢測炔螨特殘留量時，關(guān)鍵技術(shù)在于能夠獲取到特異性強、靈敏度高的抗體，而要實現(xiàn)這一目標(biāo)，前提條件就是得制備出合適的炔螨特半抗原。但是，目前國內(nèi)還沒有針對炔螨特半抗原的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種炔螨特半抗原及其合成方法和應(yīng)用，通過結(jié)合炔螨特的結(jié)構(gòu)特點設(shè)計出一種炔螨特半抗原的合成方法，并將其應(yīng)用于合成炔螨特人工抗原，從而誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生抗體，建立炔螨特各種免疫分析方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種炔螨特半抗原，其結(jié)構(gòu)如下所示：


一種炔螨特半抗原的合成方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)取4-叔丁基苯酚和1,2-環(huán)氧-4-乙烯基環(huán)己烷混合，攪拌之后加入堿和溶劑反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物i；

2)取甲苯和氯化亞砜混合，降溫至0℃開始攪拌，加入中間產(chǎn)物i，冰浴條件下反應(yīng)，得中間產(chǎn)物ii，冷藏；

3)取甲苯、三乙胺和丙炔醇混合，通氮氣，冰浴條件下攪拌，滴加步驟2)制得的中間產(chǎn)物ii，先冰浴反應(yīng)，后室溫反應(yīng)，之后加入乙酸乙酯和純水反復(fù)萃取有機層，得中間產(chǎn)物iii；

4)取步驟3)制得的中間產(chǎn)物iii、3-巰基丙酸、安息香雙甲醚和二氯甲烷混合，攪拌，紫外光照，反應(yīng)之后得半抗原iv；

以上所有反應(yīng)的合成路線如下：


其中，oh-代表氫氧化物；socl2代表氯化亞砜；tea代表三乙胺；i、ii、iii分別代表如上三個化合物，iv為炔螨特半抗原。

其中，步驟1)中所述4-叔丁基苯酚與1，2-環(huán)氧-4-乙烯基環(huán)己烷的用量摩爾比為1.0：(1.0-1.2)；所述堿包括氫氧化鈉或者氫氧化鉀；所述溶劑包括甲苯或者純化水；

步驟2)中所述中間產(chǎn)物i與氯化亞砜的用量摩爾比為1.0：(1.0-1.5)；中間產(chǎn)物i與甲苯的質(zhì)量體積比為1.0g：(1.0ml-5.0ml)；

步驟3)中所述中間產(chǎn)物i、丙炔醇和三乙胺的用量摩爾比為1.0：(1.5-2.0)：(1.5-2.0)；所述滴加中間產(chǎn)物ii時控制溫度在0～5℃；

步驟4)中所述中間產(chǎn)物iii、3-巰基丙酸和安息香單甲醚的用量摩爾比為1.0：(1.5-3.0)：0.1；所述紫外波長為254～365nm。

優(yōu)選方案如下：

步驟1)稱取4-叔丁基苯酚和1,2-環(huán)氧-4-乙烯基環(huán)己烷置于三口瓶中，室溫攪拌至溶清，加入堿和溶劑，攪拌反應(yīng)；反應(yīng)完畢后，用5％氫氧化鈉溶液洗滌3次；有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液柱層析分離，得中間產(chǎn)物i；

優(yōu)選地，其中所述反應(yīng)溶劑包括但不限于苯、甲苯、二甲苯和水中的一種或多種；所述堿包括但不限于氫氧化鉀、氫氧化鈉和碳酸鉀中的一種或多種；更優(yōu)選地，所述4-叔丁基苯酚與1,2-環(huán)氧-4-乙烯基環(huán)己烷的摩爾比為1.0:1.2；將各原料用量控制在上述范圍內(nèi)，一方面有利于進一步提高化合物1的產(chǎn)率，一方面有利于避免原料過度浪費；

步驟2)將甲苯和氯化亞砜置于二口反應(yīng)瓶中，降溫至0℃攪拌，分次加入中間產(chǎn)物i，冰浴反應(yīng)；冰箱冷藏放置，直接用于下步反應(yīng)，得中間產(chǎn)物ii。

更優(yōu)選地，所用物料中間產(chǎn)物i與氯化亞砜的摩爾比為1.0:1.2；更優(yōu)選地，所用物料中間產(chǎn)物i與甲苯的質(zhì)量體積比為:1.0g:2.0ml；

步驟3)將甲苯、三乙胺和丙炔醇一次置于三口瓶中，氮氣保護，冰浴下攪拌，滴加步驟2中所制中間產(chǎn)物ii；滴畢后繼續(xù)冰浴下攪拌30min，再升溫至室溫攪拌；反應(yīng)完畢后，加入乙酸乙酯和純化水，攪拌分液，取有機層；水層再用乙酸乙酯萃取，合并有機層；有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液蒸餾至干，得中間產(chǎn)物iii；

更優(yōu)選地，所用物料中間產(chǎn)物i、丙炔醇和三乙胺的摩爾比為1.0:1.5:2.0；

步驟4)將步驟3所制中間產(chǎn)物iii、3-巰基丙酸、安息香雙甲醚和二氯甲烷依次置于單口瓶中，室溫攪拌溶清，紫外光照；反應(yīng)完畢后反應(yīng)液直接柱層析分離，得半抗原iv；

更優(yōu)選地，所用物料中間產(chǎn)物iii、3-巰基丙酸和安息香單甲醚的摩爾比為1.0:2.0:0.1；所用照射用紫外波長254nm、365nm或254nm和365nm同時使用，更優(yōu)選地，254nm和365nm同時使用。

一種炔螨特半抗原的應(yīng)用，所述炔螨特半抗原用于制備炔螨特人工免疫抗原；炔螨特半抗原應(yīng)用于食品中炔螨特殘留檢測的免疫分析。

本發(fā)明的技術(shù)效果如下：

本發(fā)明公開了一種炔螨特半抗原及其合成方法和應(yīng)用，其合成以4-叔丁基苯酚和1,2-環(huán)氧-4-乙烯基環(huán)己烷為起始原料經(jīng)過4步反應(yīng)得到最終目標(biāo)物，合成的炔螨特半抗原既最大程度保留了炔螨特的特征結(jié)構(gòu)，使得炔螨特半抗原的免疫原性明顯增強，又具有可以與載體發(fā)生偶聯(lián)的羧基，為后續(xù)建立炔螨特的各種免疫分析方法提供基礎(chǔ)；炔螨特半抗原與載體偶聯(lián)后得到的炔螨特人工抗原去免疫動物，更有利于刺激動物免疫應(yīng)答產(chǎn)生特異性更強、靈敏度更高的抗體，為后續(xù)建立炔螨特的各種免疫分析方法提供基礎(chǔ)；

本發(fā)明根據(jù)炔螨特的結(jié)構(gòu)特點，合理設(shè)計炔螨特半抗原的合成方法，使用的原料價廉易得，實驗操作簡單，反應(yīng)條件溫和；本發(fā)明合成的炔螨特半抗原的純度和收率高，合成的氨基酸類除螨劑半抗原的收率可達35％以上。

具體實施方式

以下通過具體的實施案例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定。

本發(fā)明中的安息香雙甲醚采購自安耐吉化學(xué)試劑公司，cas號為24650-42-8，產(chǎn)品編號為d070132，若無特殊說明，本發(fā)明的其余原料和試劑均為常規(guī)市場的原料、試劑。

實施例1

一種炔螨特半抗原的制備方法，包括如下步驟：

(1)4-叔丁基苯酚和1,2-環(huán)氧-4-乙烯基環(huán)己烷反應(yīng)制備中間產(chǎn)物i：

往50ml單口瓶中依次加入4-叔丁基苯酚(1.00g，6.66mmol)和1,2-環(huán)氧-4-乙烯基環(huán)己烷(1.00g，8.00mmol)，室溫攪拌至溶清；再加入氫氧化鉀(75mg，1.33mmol)和甲苯(1.00ml)，升溫至105℃攪拌18h；降至室溫攪拌，加入甲苯(20ml)，用5％氫氧化鈉溶液(60ml)均分三次洗滌，取有機層；有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，取濾液；濾液柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯，體積比為10:1；分出目標(biāo)液，蒸餾除去溶劑，得無色透明油狀物1.7g，即為中間產(chǎn)物i，收率：93％。

(2)中間產(chǎn)物i與氯化亞砜反應(yīng)制備中間產(chǎn)物ii

往50ml單口瓶中依次加入甲苯(1.10ml)和氯化亞砜(0.18ml，2.40mmol)，室溫下攪拌5min；降溫至0～5℃攪拌，在30min內(nèi)分4～6次加入中間產(chǎn)物i(550mg，2.00mmol)；加完后繼續(xù)0～5℃攪拌5h，再放冰箱冷藏(0～5℃)18h，得中間產(chǎn)物ii的甲苯溶液，直接用于下步反應(yīng)。

(3)中間產(chǎn)物ii與丙炔醇的反應(yīng)制備中間產(chǎn)物iii

往50ml單口瓶中依次加入甲苯(1.00ml)、三乙胺(400mg，4.00mmol)和丙炔醇(168mg，3.00mmol)，氮氣保護，室溫下攪拌30min；降溫至0～5℃攪拌，在30min內(nèi)滴加完上述中間產(chǎn)物ii的甲苯溶液；滴完后繼續(xù)0～5℃攪拌30min，升至室溫攪拌3h；往反應(yīng)液中加入乙酸乙酯(20ml)和純化水(20ml)，攪拌分液，取有機層，水層再用乙酸乙酯(20ml)萃取，合并有機層；有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯，體積比為10:1；分出目標(biāo)液，蒸餾除去溶劑，得無色透明油狀物0.58g，即為中間產(chǎn)物iii，步驟(2)和(3)合并收率：81.1％。

(4)中間產(chǎn)物iii與3-巰基丙酸反應(yīng)制備半抗原iv

往50ml單口瓶中依次加入中間產(chǎn)物iii(440mg，1.17mmol)、3-巰基丙酸(250mg，2.36mmol)、安息香雙甲醚(30mg，0.12mmol)和二氯甲烷(8.80ml)，室溫攪拌至溶清；紫外光照射，波長254nm和365nm，光照時間6h；將反應(yīng)液直接柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯，體積比為2:1；分出目標(biāo)液，蒸餾除去溶劑，得無色透明油狀物268mg，即為半抗原iv，收率：47.5％。

實施例2

一種炔螨特半抗原的制備方法，包括如下步驟：

(1)4-叔丁基苯酚和1,2-環(huán)氧-4-乙烯基環(huán)己烷反應(yīng)制備中間產(chǎn)物i：

往50ml單口瓶中依次加入氫氧化鈉(350mg，8.66mmol)和純化水(13.00ml)，室溫攪拌至溶清；加入4-叔丁基苯酚(1.00g，6.66mmol)，室溫攪拌至溶清；在3～5min滴加1,2-環(huán)氧-4-乙烯基環(huán)己烷(1.00g，8.00mmol)，室溫攪拌至溶清，室溫反應(yīng)18h；將反應(yīng)液過濾，濾餅用純化水(40ml)分兩次洗滌，再用正己烷(20ml)洗滌，所得濾餅室溫晾干；白色固體1.65g，即為中間產(chǎn)物i，收率：90.3％。

(2)中間產(chǎn)物i與氯化亞砜反應(yīng)制備中間產(chǎn)物ii

往50ml單口瓶中依次加入甲苯(1.10ml)和氯化亞砜(0.22ml，3.00mmol)，室溫下攪拌5min；降溫至0～5℃攪拌，在30min內(nèi)分4～6次加入中間產(chǎn)物i(550mg，2.00mmol)；加完后繼續(xù)0～5℃攪拌5h，再放冰箱冷藏(0～5℃)18h，得中間產(chǎn)物ii的甲苯溶液，直接用于下步反應(yīng)。

(3)中間產(chǎn)物ii與丙炔醇的反應(yīng)制備中間產(chǎn)物iii

往50ml單口瓶中依次加入甲苯(1.00ml)、三乙胺(400mg，4.00mmol)和丙炔醇(168mg，3.00mmol)，氮氣保護，室溫下攪拌30min；降溫至0～5℃攪拌，在30min內(nèi)滴加完上述中間產(chǎn)物ii的甲苯溶液；滴完后繼續(xù)0～5℃攪拌30min，升至室溫攪拌3h；往反應(yīng)液中加入乙酸乙酯(20ml)和純化水(20ml)，攪拌分液，取有機層，水層再用乙酸乙酯(20ml)萃取，合并有機層；有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯，體積比為10:1；分出目標(biāo)液，蒸餾除去溶劑，得無色透明油狀物0.50g，即為中間產(chǎn)物iii，步驟(2)和(3)合并收率：66.3％。

(4)中間產(chǎn)物iii與3-巰基丙酸反應(yīng)制備半抗原iv

往50ml單口瓶中依次加入中間產(chǎn)物iii(440mg，1.17mmol)、3-巰基丙酸(250mg，2.36mmol)、安息香雙甲醚(30mg，0.12mmol)和二氯甲烷(8.80ml)，室溫攪拌至溶清；紫外光照射，波長365nm，光照時間6h；將反應(yīng)液直接柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯，體積比為2:1；分出目標(biāo)液，蒸餾除去溶劑，得無色透明油狀物208mg，即為半抗原iv，收率：36.9％。

上述僅為本發(fā)明的部分具體實施方式，但本發(fā)明的設(shè)計構(gòu)思不局限于此，凡利用此構(gòu)思對本發(fā)明進行非實質(zhì)性的改動，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護范圍的行為。但凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何形式的簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。